Σύμφωνα με σύγχρονες μαρτυρίες, ο Τζέιμς δεν ήταν καλά για αρκετούς μήνες πριν από το θάνατό του, υπέφερε από διάφορα συμπτώματα όπως πόνο στο στήθος, δύσπνοια και πεπτικά προβλήματα. Είχε επίσης βιώσει περιόδους ακανόνιστης συμπεριφοράς και κατάθλιψης. Στις 21 Μαρτίου 1625, ο Τζέιμς υπέστη ένα σοβαρό εγκεφαλικό που τον άφησε παράλυτο στην αριστερή πλευρά του σώματός του. Δεν μπορούσε να μιλήσει ή να κινηθεί και η κατάστασή του επιδεινώθηκε γρήγορα.
Ο Τζέιμς πέθανε έξι μέρες αργότερα, περιτριγυρισμένος από την οικογένειά του και τους συμβούλους του. Τάφηκε στο Αβαείο του Γουέστμινστερ στις 5 Απριλίου 1625. Ο γιος του Κάρολος Α' τον διαδέχθηκε στο θρόνο.
Ενώ η ακριβής αιτία θανάτου είναι άγνωστη, πιστεύεται ότι ένας συνδυασμός παραγόντων συνέβαλαν στον θάνατο του Τζέιμς, συμπεριλαμβανομένης της επιδείνωσης της υγείας του, του εγκεφαλικού επεισοδίου και του τριτογενούς άγχους. Ορισμένες σύγχρονες μαρτυρίες υποδηλώνουν επίσης ότι ο Τζέιμς μπορεί να έχει δηλητηριαστεί, αλλά δεν υπάρχουν συγκεκριμένα στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτόν τον ισχυρισμό.